Recebi recentemente um email de um leitor deste blog, Diego Sangiorgi, que precisava quantificar o crescimento de algas em uma placa de petri usando a cor da imagem. Depois de encontrar a solução, obtive dele a permissão para usar as imagens neste tutorial.

Para medir o crescimento das algas vou usar algumas ferramentas do ImageJ das quais ainda não falei aqui: Ferramentas de seleção manual e o ROI Manager; além das medições que já usei algumas vezes.

O problema

Placas com algas em crescimento. Imagens de Diego Sangiorgi.

Fiz uma montagem com as 5 imagens que recebi, com as placas em ordem. A primeira imagem tem menos algas e a última tem mais. Aos nossos olhos, a cor verde fica mais intensa conforme as imagens crescem. Por isso, seria de esperar que, medindo a intensidade do canal verde, teríamos uma boa relação com o crescimento das algas, certo?

ERRADO.

As próximas imagens são montagens feitas com os canais verdes e azuis, na mesma ordem das imagens originais. Não é possível ver diferença entre as imagens no canal verde, mas as do canal azul ficam mais escuras conforme as algas crescem. Isto acontece porque o que chamamos de verde tem bastante azul, quando representado no modelo de cor RGB.

Montagem do canal azul das algas.

Montagem com o canal verde das algas.

Preparação das imagens

Considerando que temos cinco imagens (e no experimento real poderiam ser mais), a melhor maneira de começar é abrindo todas elas e criando uma stack. Abra-as na ordem certa, para que o ImageJ monte a stack na ordem também. Depois de abrir todas as imagens, vá em Image –> Stacks –> Images to stack.

Para separar os canais, use Image –> Color –> Split Channels. Isto vai criar trés stacks em tons de cinza, com o canal identificado na barra de título. Identifique o canal azul (blue) e descarte os outros dois.

Identificação das áreas de medição

Para indicar ao ImageJ qual a área faz parte da placa de petri em cada imagem, vamos usar o ROI Mananger e uma ferramenta de seleção elíptica.

1. Primeiro abra do ROI Manager (gerenciador de regiões de interesse). Fica em Analyse –> Tools –> ROI Manager. Uma janela vazia, com alguns botões à direita.

2. Agora clique em , depois use clique e arraste sobre a imagem para desenhar uma elipse. Não se preocupe em acertar da primeira vez, você pode ajustar depois.

3. Quando estiver contente com a sua seleção, Clique no botão Add, do ROI Manager. Sua seleção (um grupo de números) vai aparecer na janela.

4. Repita a seleção para todas as imagens da sua Stack.

Quanto terminar, terá a janela do ROI Manager populada com suas amostras, ou regiões de interesse.

Medição

Antes de medir, precisamos informar ao programa quais medidas vamos usar. Precisamos apenas da intensidade do tom de cinza dos pixels. Abra o diálogo das medidas em Analyse –> Set Measurements… e selecione a opção Mean Gray Value (média dos valores de cinza).

Agora sim, medir: Clique no botão Measure do ROI Manager.

Resultados

Se tudo seu certo, o último passo deve ter aberto uma janela de resultados com esta:

O campo Mean traz a média de tons de cinza do canal azul de cada imagem. Ele decresce (fica mais escuro) enquanto as algas crescem, e sua cor vai ficando mais intensa.

A relação exata entre a diminuição da intensidade do azul só pode ser obtida por pesquisa, talvez relacionando o peso seco das algas à média da intensidade. Mas isso é a parte dos biólogos, que dominam a área de aplicação do método.

Créditos e Agradecimentos

As imagens e o assunto deste tutorial foram cedidos pelo estudante de biologia Diego Sangiorgi. Muito obrigada!