Hoje é a vez de um leitor contar como se livrou do papel milimetrado e fez o trabalho todo em bem menos tempo, usando usando o ImageJ. Eduardo me enviou este passo a passo para dividir com outras pessoas o que ele aprendeu – tem umas dicas legais de como usar as ferramentas disponíveis no software para resolver os problemas encontrados em situações reais.

Análise da área foliar no ImageJ

Foto da folha: repare no fundo branco feito com papel apoiado na prancheta, e a escala desenhada a lápis na parte de cima - esses cuidados são essenciais!

Tratando e analisando o dano na folha

1. Abra o programa, em seguida a foto no menu File clique em Open e escolha o diretório onde está salva sua foto e selecione-a.
2. No menu Analyze clique em Set mesurements
3. Habilite apenas as opções: Area, Min & max gray value, Area fraction na primeira coluna e Mean gray value, Perimeter e Median na segunda coluna. Em baixo Decimal places (0-9) coloque 1 (uma casa decimal). Clique OK.
4. Clique na janela da foto. Agora a brincadeira começa.
5. Determine a medida conhecida (no caso 4cm ou 40mm tracejada a lápis na folha branca de fundo) com a ferramenta Straight (é uma linha reta entre o arco de ângulo e o coração) na barra de ferramentas abaixo do menu.
6. Use a lupa, Magnifying glass (clique com botão esquerdo do mouse para aproximar, clique com botão direito afasta, ou use as teclas correspondente a + e -). Dê um zoom na medida desenhada e passe a linha sobre ela. Pronto?
7. Agora volte no menu novamente em Analyze. Clique Set scale…, vai abrir uma janela: em Known distance digite 40 (para milímetros ou 4 para centímetros), em Unit of leight digite mm (milímetros, ou cm para centímetros). Habilite a opção Global scale. Você verá a resolução da equação que transforma pixels em unidades de medida logo abaixo em Scale: “um número” pixels/mm. Clique OK. (Mais informações sobre essa parte aqui.)
8. Volte para a janela da foto e comece a retirar tudo o que não for folha como sombras, dedos, pecíolo, tudo… com a ferramenta Freehand sections que é o coração, a ferramenta de corte, contornando a área que deve ser retirada. Depois vá no menu Edit e clique em Fill, isso vai preencher a área que você seccionou na foto com a cor branca. Ótimo. Lembre-se que se precisar de outras cores para preencher as secções que você selecionou use a ferramenta Color picker, que parece (ou realmente é) um conta-gotas, e clique sobre a cor desejada. Volte o conta-gotas para a cor branca, você pode precisar.
9. Agora contorne a folha da planta com a mesma Freehand section e volte no menu Edit. Clique em Clear outside. Sobrou só a folha na foto? Excelente! Então salve o arquivo: no menu File vá em Save as… e escolha o formato que deseja salvar. Eu gosto do PNG porque a foto não perde informações eletrônicas quando é salvada mais vezes (ao contrário do formato JPG). Salvou?
10. Agora preencha os danos foliares de cores mais escuras como áreas e pontuações negras. Em algumas fotos de menor qualidade, será necessário o preenchimento de todos os danos foliares, mesmo os de cor mais clara, para que o threshold pegue tudo certinho. Use as ferramentas de corte como a Freehand sections e as de preenchimento como o Paintbrush tool (o pincelzinho) e preencha onde há danos na folha. Lembre-se que você pode determinar a espessura do pincel, o Paintbrush tool clicando no ícone com o botão direito do mouse. Eu gosto da espessura de 5 pixels (digite 5 na opção e clique OK). O Paintbrush tool é melhor para danos que parecem pontuações e danos menores, e o Freehand sections é melhor para grandes áreas enegrecidas e apodrecidas. Lembre-se de usar a lupa sempre que necessário. Deu certo? Agora vai!
11. No menu Image tem a opção Type que habilita você a transformar a imagem em formatos de cores ou escala de cinza. Precisamos da escala de cinza, então clique na opção 8-bit. Você verá que a foto tomou cores acinzentadas. Isso é bom, pois o Threshold direto na imagem colorida dá muita dor de cabeça.
12. Agora volte no menu Image, vá em Adjust e clique em Threshold. Uma janelinha abre com uma área de gráfico, duas barras de rolagem, duas caixas de seleção multi-opcional e uma opção de habilitação. Nessas duas caixas certifique-se de que a primeira esteja escrito Default (já vem assim, não precisa mexer) e na outra esteja escrito Red. Deixe a opção Dark Background desmarcada, não há necessidade de ter um fundo escuro. Ajuste o gradiente de Threshold com a barra de rolagem inferior de acordo com a folha da planta e clique em Apply. Do lado direito dessa barra tem um numero. Decore-o para não precisar achar o Threshold correto de novo (eu sempre coloco esse numero no excel junto com os outros dados, que virão a seguir; sempre uso múltiplos de 5 pra ajudar a lembrar). A área da folha tá vermelha? Ótimo! É assim mesmo.
13. Achou que não ficou muito bom? A área deixou de pegar algumas partes da folha e/ou pegou partes que não eram folha? Então clique em Reset e faça algumas alterações na foto, como retirar essas áreas mais escuras que o Threshold pegou ou escurecer algumas partes claras da folha qual o sol ou o flash (ou qualquer outra coisa) refletiu: use novamente a ferramenta freehand sections e circule a área que está te atrapalhando, vá no menu Image e em Adjust, depois clique em Brightness/contrast, abrirá uma janela, vá mexendo na barra de rolagem (eu gosto de mexer só na barra de rolagem que está escrito brightness embaixo) até esta área escurecer (não se assuste se a folha toda escurecer) e clique em Apply. Ou Reset se você quer fazer de novo.
14. Aí sim, volte no Threshold e acerte novamente a área da folha clique em Apply. Você verá que sua folha ficou preta e o fundo branco. Excelente! Isso é que é binarizar uma foto. É assim que o programa acha a área foliar.
15. Agora volte no menu Analyze e procure por Analize particles… Abrirá uma janelinha com um monte de trem, ignore tudo, menos as opções que estão na parte inferior da janela: certifique-se que somente Display results, Clear results e Summarize estejam habilitadas. Clique OK. Ignore a janelinha Summary. Você verá a janelinha Results que mostra as medias que o Threshold pegou com o numero da media, a área da folha, mean, max e min, perímetro e porcentagem da área. Clicando sobre esse resultado você pode copiá-lo numa planilha de excel, então faça isso. Lembre-se de quando for fazer a planilha coloque duas linhas para cada folha da planta Eu gosto de por os resultados desse primeiro momento na linha de baixo.

Para fotos com duas ou mais folhas é bom usar a opção Show: Outlines, que enumera as folhas em outra janela (não vê numero nenhum? Experimente usar a lupa), assim você não se perde na tabela das medidas na janela Results.
Parece difícil, mas não é não.

Analisando a folha inteira, sem danos, ou seja, a área total da folha.

1. Você pode simplesmente copiar seu resultado do primeiro passo (acima), voltar à foto e preencher os buracos, quando a folha não tem dano marginal. Vá no menu Process, depois em Binary e clique em Fill holes. Pronto. Volte em Analyze, Analize particles… e clique OK. O programa pergunta se você quer salvar a ultima análise, se você já salvou esses dados no excel então clique em No. Agora, na janela Results tem os dados com a área da folha inteira. Copie esses dados no excel, na linha de cima.
2. Se tiver dano marginal e você os retirou para a primeira análise, nada tema! Se você salvou a foto em PNG é só abri-la no menu File e Open. Lembra que você selecionou a opção Global scale no Set scale, quando você foi ajustar a escala milímetros? Ótimo então você não precisa reajustar a escala, se é a mesma foto. É só colocar a foto na escala de cinza (Image>Type>8-bit), ajustar o Threshold (Image>Adjust>Threshold) e rodar os resultados (Analyze>Analyze particles).

Pronto! Repita o processo para cada foto e no final você tem uma bela tabela no excel com os dados da sua folha! Use o excel também ao seu favor, faça as contas lá também.

Tem jeito de ficar mais fácil? Tem sim! Utilize teclas de atalho, algumas funções no programa já têm. Para aquelas que não tem e você usa muito vá no menu Plugins, Shortcut, Create shortcut e divirta-se! Eu uso o teclado numérico em cima das letras pra isso: 6 para Set scale, 7 para 8-bit, 8 para Threshold, 9 para Analyze particles e 0 para Fill holes.

Você não precisa mais chutar o dano foliar da sua planta pelo olhômetro ou usar o diabo do papel milimetrado. O ImageJ é gratuito, use a abuse!

Os Ecólogos também podem usar o poder dos softwares!

Bom proveito!

Créditos

O texto e as imagens originais foram enviados por Eduardo M. S. Borges-Filho, do Laboratório de Ecologia do Comportamento e de Interações na UFU.
Muito obrigada, Eduardo!