Análise da área foliar no ImageJ

Foto da folha: repare no fundo branco feito com papel apoiado na prancheta, e a escala desenhada a lápis na parte de cima - esses cuidados são essenciais!

Tratando e analisando o dano na folha

1. Abra o programa, em seguida a foto no menu File clique em Open e escolha o diretório onde está salva sua foto e selecione-a.
2. No menu Analyze clique em Set mesurements
3. Habilite apenas as opções: Area, Min & max gray value, Area fraction na primeira coluna e Mean gray value, Perimeter e Median na segunda coluna. Em baixo Decimal places (0-9) coloque 1 (uma casa decimal). Clique OK.
4. Clique na janela da foto. Agora a brincadeira começa.
5. Determine a medida conhecida (no caso 4cm ou 40mm tracejada a lápis na folha branca de fundo) com a ferramenta Straight (é uma linha reta entre o arco de ângulo e o coração) na barra de ferramentas abaixo do menu.
6. Use a lupa, Magnifying glass (clique com botão esquerdo do mouse para aproximar, clique com botão direito afasta, ou use as teclas correspondente a + e -). Dê um zoom na medida desenhada e passe a linha sobre ela. Pronto?
7. Agora volte no menu novamente em Analyze. Clique Set scale…, vai abrir uma janela: em Known distance digite 40 (para milímetros ou 4 para centímetros), em Unit of leight digite mm (milímetros, ou cm para centímetros). Habilite a opção Global scale. Você verá a resolução da equação que transforma pixels em unidades de medida logo abaixo em Scale: “um número” pixels/mm. Clique OK. (Mais informações sobre essa parte aqui.)
8. Volte para a janela da foto e comece a retirar tudo o que não for folha como sombras, dedos, pecíolo, tudo… com a ferramenta Freehand sections que é o coração, a ferramenta de corte, contornando a área que deve ser retirada. Depois vá no menu Edit e clique em Fill, isso vai preencher a área que você seccionou na foto com a cor branca. Ótimo. Lembre-se que se precisar de outras cores para preencher as secções que você selecionou use a ferramenta Color picker, que parece (ou realmente é) um conta-gotas, e clique sobre a cor desejada. Volte o conta-gotas para a cor branca, você pode precisar.
9. Agora contorne a folha da planta com a mesma Freehand section e volte no menu Edit. Clique em Clear outside. Sobrou só a folha na foto? Excelente! Então salve o arquivo: no menu File vá em Save as… e escolha o formato que deseja salvar. Eu gosto do PNG porque a foto não perde informações eletrônicas quando é salvada mais vezes (ao contrário do formato JPG). Salvou?
10. Agora preencha os danos foliares de cores mais escuras como áreas e pontuações negras. Em algumas fotos de menor qualidade, será necessário o preenchimento de todos os danos foliares, mesmo os de cor mais clara, para que o threshold pegue tudo certinho. Use as ferramentas de corte como a Freehand sections e as de preenchimento como o Paintbrush tool (o pincelzinho) e preencha onde há danos na folha. Lembre-se que você pode determinar a espessura do pincel, o Paintbrush tool clicando no ícone com o botão direito do mouse. Eu gosto da espessura de 5 pixels (digite 5 na opção e clique OK). O Paintbrush tool é melhor para danos que parecem pontuações e danos menores, e o Freehand sections é melhor para grandes áreas enegrecidas e apodrecidas. Lembre-se de usar a lupa sempre que necessário. Deu certo? Agora vai!
11. No menu Image tem a opção Type que habilita você a transformar a imagem em formatos de cores ou escala de cinza. Precisamos da escala de cinza, então clique na opção 8-bit. Você verá que a foto tomou cores acinzentadas. Isso é bom, pois o Threshold direto na imagem colorida dá muita dor de cabeça.
12. Agora volte no menu Image, vá em Adjust e clique em Threshold. Uma janelinha abre com uma área de gráfico, duas barras de rolagem, duas caixas de seleção multi-opcional e uma opção de habilitação. Nessas duas caixas certifique-se de que a primeira esteja escrito Default (já vem assim, não precisa mexer) e na outra esteja escrito Red. Deixe a opção Dark Background desmarcada, não há necessidade de ter um fundo escuro. Ajuste o gradiente de Threshold com a barra de rolagem inferior de acordo com a folha da planta e clique em Apply. Do lado direito dessa barra tem um numero. Decore-o para não precisar achar o Threshold correto de novo (eu sempre coloco esse numero no excel junto com os outros dados, que virão a seguir; sempre uso múltiplos de 5 pra ajudar a lembrar). A área da folha tá vermelha? Ótimo! É assim mesmo.
13. Achou que não ficou muito bom? A área deixou de pegar algumas partes da folha e/ou pegou partes que não eram folha? Então clique em Reset e faça algumas alterações na foto, como retirar essas áreas mais escuras que o Threshold pegou ou escurecer algumas partes claras da folha qual o sol ou o flash (ou qualquer outra coisa) refletiu: use novamente a ferramenta freehand sections e circule a área que está te atrapalhando, vá no menu Image e em Adjust, depois clique em Brightness/contrast, abrirá uma janela, vá mexendo na barra de rolagem (eu gosto de mexer só na barra de rolagem que está escrito brightness embaixo) até esta área escurecer (não se assuste se a folha toda escurecer) e clique em Apply. Ou Reset se você quer fazer de novo.
14. Aí sim, volte no Threshold e acerte novamente a área da folha clique em Apply. Você verá que sua folha ficou preta e o fundo branco. Excelente! Isso é que é binarizar uma foto. É assim que o programa acha a área foliar.
15. Agora volte no menu Analyze e procure por Analize particles… Abrirá uma janelinha com um monte de trem, ignore tudo, menos as opções que estão na parte inferior da janela: certifique-se que somente Display results, Clear results e Summarize estejam habilitadas. Clique OK. Ignore a janelinha Summary. Você verá a janelinha Results que mostra as medias que o Threshold pegou com o numero da media, a área da folha, mean, max e min, perímetro e porcentagem da área. Clicando sobre esse resultado você pode copiá-lo numa planilha de excel, então faça isso. Lembre-se de quando for fazer a planilha coloque duas linhas para cada folha da planta Eu gosto de por os resultados desse primeiro momento na linha de baixo.

Para fotos com duas ou mais folhas é bom usar a opção Show: Outlines, que enumera as folhas em outra janela (não vê numero nenhum? Experimente usar a lupa), assim você não se perde na tabela das medidas na janela Results.
Parece difícil, mas não é não.

Analisando a folha inteira, sem danos, ou seja, a área total da folha.

1. Você pode simplesmente copiar seu resultado do primeiro passo (acima), voltar à foto e preencher os buracos, quando a folha não tem dano marginal. Vá no menu Process, depois em Binary e clique em Fill holes. Pronto. Volte em Analyze, Analize particles… e clique OK. O programa pergunta se você quer salvar a ultima análise, se você já salvou esses dados no excel então clique em No. Agora, na janela Results tem os dados com a área da folha inteira. Copie esses dados no excel, na linha de cima.
2. Se tiver dano marginal e você os retirou para a primeira análise, nada tema! Se você salvou a foto em PNG é só abri-la no menu File e Open. Lembra que você selecionou a opção Global scale no Set scale, quando você foi ajustar a escala milímetros? Ótimo então você não precisa reajustar a escala, se é a mesma foto. É só colocar a foto na escala de cinza (Image>Type>8-bit), ajustar o Threshold (Image>Adjust>Threshold) e rodar os resultados (Analyze>Analyze particles).

Pronto! Repita o processo para cada foto e no final você tem uma bela tabela no excel com os dados da sua folha! Use o excel também ao seu favor, faça as contas lá também.

Tem jeito de ficar mais fácil? Tem sim! Utilize teclas de atalho, algumas funções no programa já têm. Para aquelas que não tem e você usa muito vá no menu Plugins, Shortcut, Create shortcut e divirta-se! Eu uso o teclado numérico em cima das letras pra isso: 6 para Set scale, 7 para 8-bit, 8 para Threshold, 9 para Analyze particles e 0 para Fill holes.

Você não precisa mais chutar o dano foliar da sua planta pelo olhômetro ou usar o diabo do papel milimetrado. O ImageJ é gratuito, use a abuse!

Os Ecólogos também podem usar o poder dos softwares!

Bom proveito!

Créditos

O texto e as imagens originais foram enviados por Eduardo M. S. Borges-Filho, do Laboratório de Ecologia do Comportamento e de Interações na UFU.
Muito obrigada, Eduardo!

O Carlos tem um problema interessante sobre análise de solda que, apesar de simples, não vai encontrar nenhum software que o resolva de forma direta. No ImageJ vou mostrar um caminho com ferramentas de seleção manual e threshold.

A imagem

Este é um perfil de solda, e precisamos medir a quantidade de material que penetrou sob a superfície inicial. O bom é que o fundo é escuro e o material de solda é bem claro, assim não teremos problemas de segmentação.

Recebi esta imagem em JPG, por isso a primeira coisa é transformar para 8 bits… você sabe o que os programas fazem quando você pega uma imagem em tons de cinza e salva em JPG? Eles criam mais duas bandas, cópias da original, para depois compactar perdendo parte dos dados. Você acaba com uma imagem de informações repetidas e de menor qualidade. Então para quê fazer isso? Tá, eu sei, a maioria das pessoas não sabe disso… por isso continuam fazendo. Tem até câmeras que fazem isso por padrão! Mas isso é só um desabafo, vamos à solução do problema.

Passo a passo

Depois de converter para tons de cinza (8bits, por exemplo: Image –> Type –> 8-bit)…

Primeiro vou calcular a área do material de solda, que vamos chamar de “Área Total”:

1. Use o threshold em Image –> Adjust –> Threshold, e cuide para eliminar o máximo de outros objetos, sem destruir a área que queremos calcular.O resultado é a área de interesse, mais alguns pontinhos, e a escala.
2. Para tirar os pontinhos vamos usar Fechamento. No ImageJ a única forma de ter controle dos parâmetros do fechamento é usando as opções. Abra o diálogo em Process –> Binary –> Options… No diálogo, há dois parâmetros numéricos que você pode mudar. Faça uma tentativa (dica: para eliminar pontinhos use números baixos), mude o “Do:” para “Close” e marque a opção “preview”. Na imagem você verá o resultado previsto, e pode mudar os parâmetros até ficar contente com o resultado, então clique OK.
3. A escala não sai fácil, então o melhor é cortar a imagem excluindo a escala. Podia até ter feito isso antes de começar: Clique no botão que tem um retângulo (ferramenta de seleção em retângulo), desenhe sobre a imagem uma área que inclua o que queremos medir e corte em Image –> Crop
4. Um cuidado que precisamos tomar com o ImageJ: normalmente preto vale 0 e branco vale 255, mas no ImageJ isso não funciona assim, então coloque o cursor sobre a área branca e olhe a barra de status: o valor que estiver lá é o que temos que procurar na tabela do próximo passo.
5. Agora que o que consideramos “Área total” está em branco e todo o resto está em preto, vamos em Analyze –> Histogram, que vai abrir uma janela de histograma, que não importa. Clique em “List” e procure, na tabela que vai aparecer, o registro com o número que você leu no passo anterior, que corresponde ao branco. O resultado é 71.251 pixels.

Agora a “Área penetrada”:

1. Comece novamente com a imagem original (transformada para 8bits).
2. Corte a área que interessa, deixando de fora a escala, desta vez.
3. Agora vem a parte delicada: Considerando que a linha da superfície original era reta, podemos estimar onde ela estava, traçando uma linha de um extremo a outro da solda. Vamos usar a ferramenta de seleção em polígono, para desenhar um polígono que inclui a parte da solda que não penetro na superfície original, como na figura.
4. Use Edit –> Fill para pintar o polígono de preto, descartando a área que não queremos medir.
5. Agora sequimos a mesma sequencia anterior, prestando atenção para não perder as linhas finas na operação “Close”. Neste caso, como eu não consegui apagar todos os pontos brancos usando “close”, me preocupei somente com os que ficaram mais próximos da área de interesse, depois apaguei os outros desenhando um polígono em torno deles e usando a função “Fill” com ono passo anterior.
6. O valor da área penetrada estará na linha de mesmo valor em que obtivemos a área total da tabela do histograma. Desta vez o resultado é 22.245 pixels

Resultado

A relação entre a área que penetrou e a área total é a resposta que procuramos: 22.245 / 71.251 = 0,3122.
Ou em porcentagem: 31,22 %

Como é uma relação entre duas grandezas do mesmo valor, não há unidade – por isso não precisamos da escala neste caso. Não faria diferença fazer este cálculo em centímetros quadrados, milímetros quadrados ou qualquer outra unidade – só daria mais trabalho.

É isso. Não gosto destas soluções muito manuais, mas esta é uma das situações em que automatizar daria uma complexidade muito maior do que parece. Concluir que o limite do material original é o prolongamento das superfícies laterais intactas é algo que seres humanos fazem quase sem pensar, mas não as máquinas. Levar o software a concluir isso por ele mesmo exigiria muitas fórmulas matemáticas!

Até mais!

O tutorial de hoje vai mostrar uma ferramenta que está presente no MFB_ImageJ, e que ajuda a contar células (claro, pode ser usado para outras coisas também…)

Uma imagem

A imagem foi obtida em http://www.flickr.com/photos/prep4md/2653982732/in/photostream/ e está em domínio público.

Repare como as células se sobrepõem, dificultando a segmentação automática. Neste caso, dependendo do número de imagens a analisar, não vale a pena nem tentar automatizar – é melhor achar uma forma de contar mesmo. Aí o software pode ajudar disponibilizando uma interface em que ninguém perca a conta, ou fique em dúvida se já contou ou não uma determinada célula. É isto de Cell Counter faz!

MFB_ImageJ e o plugin Cell Counter

O MBF_ImageJ é uma distribuição do ImageJ, com um conjunto de plugins específico para Microscopia. Ele é mantido pela McMaster Biophotonics Facility, do Canadá. (Instruções de instalação aqui.)

O plugin Cell Counter já vem instalado nesta distribuição, é de autoria de Kurt De Vos, da
University of Sheffield, Academic Neurology. Me parece que a versão mais atual do plugins ainda não foi colocada no MFB, mas vou usar a versão de lá assim mesmo, já que neste momento só estrou interessada nas funções básicas.

Como fazer

Primeiro abra a sua imagem (se ela for muito grande, e você for capaz de ver as células com uma resolução menor, vale à pena diminuir a imagem (use Image –> Scale para fazer isso).

Então ligue o plugin, no menu Plugins –> Particle Analysis –> Cell Counter.

A sua imagem vai aparecer dentro de uma nova janela, com alguns botões abaixo da imagem, e uma janela vazia “Results” vai aparecer na tela também.

O plugin permite que você conte células diferentes na mesma imagem, mostrando resultados por tipo e totais. Por isso, antes de começar a contar é preciso selecionar um tipo (eles são nomedos por cores para facilitar). Eu escolhi o vermelho e contei todas as células com este, porque acho que elas são todas do mesmo tipo.

Para contar, é só dar um click sobre cada célula na imagem. Os quadradinhos vão ficando no lugar para marcar as que você já contou, e a janela Results vai mostrando o resultado parcial, assim:

Quando terminar, se quiser pode resumir os resultados clicando no botão Results, abaixo da imagem. Mas isso não faz muita diferença já que seus resultados finas vão estar na última linha da tabela. Falando em tabela, você pode exportá-la em formato .xls, se precisar (no menu da janela Results, clique em File –> Salvar)

Também dá para salvar a imagem com os quadradinhos sobre ela: use o menu da janela principal do programa, e salve normalmente como faria com qualquer imagem.

Que tal? Facilita a vida?

Até mais!

Esta foi uma das imagens cedidas por Jorge Alves (a quem fiquei devendo algumas respostas ainda antes de sair de férias). Vamos a uma delas: como se usa a escala pré-definida no ImageJ, ou em qualquer outro programa parecido?

A imagem tem aumento de 1000 vezes (essa informação é fácil de obter porque só depende da lente que está sendo usada), então a escala é… bom, depende. Depende principalmente do tamanho dos pixels captados pelo sensor da câmera. O procedimento mais comum nestes casos é usar uma lâmina com uma escala impressa e fotografá-la com a mesma câmera, configurada da mesma forma, e com a mesma lente que se fotografa as amostras.

Tendo as duas imagens, fica simples calcular a escala. Vou usar o ImageJ só porque falo dele toda hora, mas outros programas que usam escala também tem procedimentos parecidos:

Em 5 passos

1. Abra as imagens com que você vai trabalhar: a do tecido, célula ou algo assim; e a da escala;

2. Agora abra a informação de escala (no ImageJ: Anialyze –> Set Scale…) certifique-se de que não haja nenhuma escala definida, ou que ela seja: No ImageJ, use a distância em pixels e a distância conhecida iguais a zero.

3. Use uma ferramenta de medição de distância para medir, na régua, a maior distância conhecida que você tiver. Aqui neste caso, eu sei que cada tracinho é um milímetro, então vou desenhar a minha linha por 12 milímetros e ver quantos pixels ela tem: 1380 pixels de comprimento.

4. De posse desta medida, abra o diálogo de escala novamente. Digite as informações como na figura – é importante marcar a caixa “Global” para indicar que todas as imagens terão aquela escala. Se você não fizer isso o programa usa aquela escala apenas para imagem em foco (a da escala) e as que interessam ficam sem escala. Eu escolhi ter a escala em milímetros, mas se quiser usá-la em micrômetros é só informar o valor em micrômetros que corresponde a 12 milímetros… (neste caso, claro).

Diálogo de Escala

5. Pronto! Agora qualquer medida sobre qualquer imagem vai sair em milímetros, na escala correta.

Medindo

Resultados das medidas

Se quiser que os resultados apareçam tabelados assim, a cada linha que desenhar clique em Analyze –> Measure. As medidas da tabela dá para salvar e usar em uma planilha.

Esta é a forma mais fácil de medir larguras e distâncias na imagem se você tem poucas medidas a fazer (e poucas imagens para medir). Não há preocupação com métodos de segmentação e de como o programa vai identificar os pontos corretos. É tudo visual e simples.

Até mais!

A Imagem

Esta imagem é minha. Tirei esta foto no quintal de um ótimo restaurante nos Caminhos de Pedra, em Bento Gonçalves.

Não sei a espécie, se alguém souber, me conte nos comentários…

A borboleta tem cores parecidas com as do tronco da árvore em que está, mas a maior parte do corpo dela é de um marrom mais escuro e menos amarelado do que a árvore.

A imagem original (bem maior que esta) está no Flickr.

Segmentação

Segmentação por Mean-shift (30;25).

Fiz algumas tentativas com crescimento de regiões, mas percebi que são ficou muito bom – As áreas mais claras da asa realmente atrapalhavam. Então lembrei que o plugin de Mean-shift que tenho instalado permite ajustar a influência do componente espacial, e achei que isso ajudaria.

Depois de algumas tentativas chequei a este resultado (usando Spacial Radius = 30 e Color Distance = 25).

Como Mean-shift demora, parei de tentar ajustar e fui ver como fica o resultado final.

Usei threshold: a banda verde da imagem segmentada formou duas modas razoavelmente distintas, então ficou fácil escolher o nivel de threshold.

Sobre este resultado, apliquei alguns fechamentos e obtive algo bem parecido com a forma da minha borboleta!

Segmentação por Treshold (esquerda) e fechamentos (direita).

Se o objetivo for medir o comprimento de uma asa a outra, este resultado já é suficiente! E dá para conseguir resultados melhores com um pouco mais de estudo e insistência…

Até mais!

Uma Imagem

Já trabalhei com a imagem escolhida em outro post (sobre como agrupar imagens em pilhas), e naquela a segmentação não ficou tão boa, no final. é uma imagem difícil justamente por causa da variedade de cores.

Vamos considerar que, no exemplo de hoje, meu interesse á contar quantos lápis aparecem na imagem. Por uma questão de amostragem, vou contar apenas aqueles em que a parte colorida (a que desenha) ficou inteira dentro do enquadramento.

O plug-in

O plug-in que vamos usar pode ser obtido em http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mean-shift.html, e foi desenvolvido por Kai Uwe Barthel (thanks!), de Berlin, na Alemanha.

Instruções de instalação estão lá no link também (se você tem Ubuntu, vai querer dar uma olhada aqui).

O processo de segmentação

Passo 1: Mean-shift

Se a instalação do plugin funcionou, você vai encontrar um item Mean Shit na parte de baixo do Menu plugin. Clique aí.

O diálogo que aparece pede dois valores: Spatial Radius e Color Distance. Como não vou entrar na teoria agora, não tenho como explicar o que cada um faz, mas pense que alterá-los muda um pouco o resultado, e que se você tem uma imagem diferente da minha provavelmente vai querer testar algumas combinações escolher a que der um resultado melhor.

Eu fiquei com Spatial Radius = 7 e Color Distance = 25.

Passo 2:  Filtro de mediana

O resultado do mean-shift foi bom, mas aqueles pontinhos escuros e ranhuras nos lápis podem atrapalhar a deteção de bordas (passo 3), então usei um filtro de mediana (valor 7 resolve) pra eliminá-los.

Passo 3:  Detecção de bordas

Se o ImageJ tivesse um algoritmo de rotulagem para imagens coloridas poderíamos usá-lo aqui e estaria tudo pronto. Mas não tem, então precisamos de alguns passos adicionais, só para chegarmos lá com as ferramentas que temos.

Use a detecção de bordas a partir do menu Process –> Find Edges. O resultado pode ser visto na primeira imagem da montagem abaixo.

Passo 4:  Elimine as cores

O threshold só funciona em tons de cinza, então converta esta imagem par a 8-bits, usando Image –> Type –> 8-bit.

Passo 5:  Treshold

Ache um ponto de threshold em que as linhas dos objetos que interessam (a parte interna dos lápis) ficam tem nítidas. Será necessário selecionar a opção “Dark backgroud”  no diálogo de treshold para que as linhas fiquem brancas e todo o resto, preto.

Passo 6: Análise

Use o Particle Analyser para rotular e obter o número de objetos.

O truque aqui é preencher os buracos (isso vai pintar dentro das bordas) e limitar a partículas com circularidade alta, (usei 0.9) – o que elimina tudo que não for muito parecido com um círculo.

O resultado é perfeito – 14 bolinhas, que representam os 14 lápis que apareceram no enquadramento da foto.

A tabela de resultados mostra todas as 14 regiões e seus valores de área o outro que tenham sido pedidos.

Crédito da imagem:

A imagem dos lápis é de *L*u*z*a*.

O problema

Pino de fibra dentro de um dente

Esta imagem é o corte de um dente no qual foi inserido um pino de fibra. A parte de fora é o dente; a de dentro com pequenas fibras circulares, é o pino de fibra, e circulando este pino há uma camada de adesivo. Em um mundo ideal a camada de adesivo aderiria completamente ao dente, mas isso não acontece, e as falhas na aderência aparecem em branco.

Em um mundo ideal também não haveria falhas [brancas] no dente ou na fibra para atrapalhar a segmentação. Isso são coisas que só acontecem no mundo real…

O objetivo aqui é quantificar as falhas na aderência do pino, que aparecem em branco, apenas na parte de fora da camada que uni o dente ao pino.

Traduzindo o problema

Com a explicação acima você provavelmente já identificou de que regiões, na imagem, eu estou falando.  Apesar de esta explicação ser suficiente para humanos ela não funciona para máquinas.

Queremos as regiões brancas… mas não todas… só as que estão na parte da fora da camada adesiva.

Desta afirmação tiramos duas características:

Regiões brancas: Característica colorimétrica; diz respeito ao valor de intensidade dos pixels. Como a diferença de intensidade entre as regiões de interesse e quase todo o restante da imagem é grande, um dos métodos de segmentação que provavelmente funcionará é o threshold.

Contidas na parte de fora da camada adesiva: Característica estrutural (diz respeito ao arranjo das regiões, umas em relação às outras – este tipo de característica é um pouco mais complexo que os outros). A presença de uma característica espacial indica que não será suficiente reconhecer só as regiões de interesse – precisaremos conhecer a localização de outras estruturas também.

Escala e outros ajustes

Antes de mais nada, ajuste a escala. Use barra horizontal na parte de baixo, que conforme está anotado abaixo dela, tem exatamente 500 micrômetros.

Agora ajuste as cores usadas pelo ImageJ: Edit –> Options… Em Foreground, selecione White (branco); em Background, selecione Black (preto). Isso vai evitar muita confusão adiante.

Identificando a estrutura de interesse

Vamos usar seleção manual desta vez. Não achei nenhuma solução automatizada, mas imagino que possa-se encontrar algo dedicando algum tempo à pesquisa.

Editando seleção circular.

Escolha a seleção circular na barra de ferramentas e use-a para desenhar um círculo na parte de fora da camada adesiva. As seleções, no ImageJ facilitam a vida, deixando que mudemos a localização dos pontos de referência com o mouse: é só arrastar.

Quando ficar feliz com o limite externo, vá em Edit –> Clear Outside. A parte de fora da seleção vai ficar toda em preto.

Depois ajuste a seleção para a parte de dentro da camada adesiva, só que desta vez use Edit –> Clear, para tornar preta a área dentro da seleção.

Agora, threshold

Depois de ficar só com a estrutura de interesse, e o resto da imagem preta, ajuste o threshold manualmente para que fiquem só as áreas brancas, e clique em Aply. Isso deve gerar uma imagem com fundo branco e as áreas (que antes eram brancas), em preto. (Na verdade acho que essas cores não fazem muito sentido, mas é assim que o ImageJ funciona)

Medição da área

Já escrevi de forma detalhada como usar o Particle Analyzer do ImageJ, então qualquer dúvida é só dar uma olhada lá.

Em Analyse –> Set Measurements, selecione Área.

Vá em Analyse –> Analyse Particles… para abrir o diálogo do analisador.

Tudo fica como está, apenas selecione Display Results e Summarize, para poder ver os resultados.

Resultado:

A tabela Results vai mostrar a área de cada partícula medida, e é útil se você quiser identificar as áreas ou mesmo eliminar algumas. No entanto, se for importante identificar regiões em separado, seria bom usar uma operação de fechamento, já que nesta escala as regiões ficaram muito finas e acabam se separando.

As áreas estão em micrômetros, como já ajustamos a escala no início.

Na tabela Summary, ficam os resultados gerais. De lá você consegue a área total.

Automatização

Automatizar o processo exige um pouco mais de pesquisa. O maior problema é identificar a camada adesiva sem que as falhas influenciem na segmentação. Eu consegui alguns resultados interessantes usando filtro de mínima, mas não chegou a ficar bom.

Créditos

A imagem é de Danielson Pontes; e quem enviou as informações foi Fabiola Silva.

Hei! Este é o post de número 101, e eu nem tinha percebido…

A JAI

Java Advanced Imaging é o nome da biblioteca da sun para processamento de imagens. O tutorial mais completo que connheço é este (mas repare que é de 1999…). Também não existe um livro para quem precisa entender ele a fundo, então as minhas principais ferramentas de estudo foram:

• A documentação da API
• O código

É, algumas vezes só olhando o código, mesmo…

Também tive a ajuda de colegas que aprenderam antes de mim, e de um tutorial em português organizado por eles, que estamos organizando para distribuir.

OK, now codding:

Depois de baixar a biblioteca, configurar o IDE, e iniciar um projeto, vem aquela sensação de “papel em branco”. O que resolve isso é uma classe main que abre a imagem e mostra a imagem (ou salva). Depois disso pronto é só achar o método que você precisa usar e colocar no meio…

Código para abrir a imagem (comece com este):


PlanarImage imagem = JAI.create("fileload", "caminho e nome do arquivo");


Para mostrar a imagem:

DisplayJAI display = new DisplayJAI(imagem); //altere o nome da variável se o resultado da sua operação tiver outro nome
//cria o frame do swing onde a imagem será exibida
JFrame frame = new JFrame("Imagem X");
//cria o scroll para efetuar as rolagens caso a imagem seja muito grande
JScrollPane scroll = new JScrollPane();
//adiciona o display dentro do scroll
scroll.setViewportView(display);
//adiciona o scroll dentro do frama
frame.add(scroll);
//define a operação padrão para o botão fechar do frame
frame.setDefaultCloseOperation(JFrame.EXIT_ON_CLOSE);
frame.setSize(400, 400); //define o tamanho do frame
frame.setVisible(true); //manda o frame ser exibido


Entre estes dois trechos de código, coloque a operação JAI de sua preferência… isso funcionou como ponto de partida para mim.

Livros! (Update, dia 11/03/2010)

Foi só falar que não tinha, que pipocaram links de livros de vários lugares. Como alguns foram por email, outros por comentários, vou listar eles aqui:

• Building Imaging Applications Java Technology
• Java Media APIs: Cross Platform Visualization
• Digital Image Processing: Practical Introduction
• Digital Image Processing: Algorithmic Introduction

Muito Obrigada pelas contribuições!

Estou estudando a JAI agora, por isso espero ter mais posts sobre ela em breve. Interessou? Assine o RSS.

Uma imagem legal…

Se quiser acompanhar o tutorial, obtenha a imagem no tamanho original.

O objetivo será separar as folhas do fundo. Dificultam a segmentação aqui a irregularidade na iluminação do primeiro plano e as cores do fundo. Quem tentar com threshold simples vai descobrir que não é possível manter todas as folhas e retirar todo o fundo ao mesmo tempo.

Vamos tentar com crescimento de regiões.

Já falei do Fiji?

Como eles dizem: “Fiji is just ImageJ, batteries included.”

É como se fosse uma distribuição diferente do ImageJ, que já vem com vários plugins e tem uma documentação própria.

Download em: http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Downloads
Para quem tem Ubuntu, use um dos links na sessão “Package for Debian/ Ubuntu”. Eu usei o de 64 bits e está funcionando bem.

Crescimento de Regiões

Crescimento de regiões, ou Region Growing, ou ainda Region Merging é um método de segmentação para imagens em tons de cinza (uma banda), que usa a variação da intensidade dos pixels e a proximidade geométrica entre eles para produzir regiões.

Ele começa em um ponto (usualmente no canto superior esquerdo) e vai “expandindo” pixel a pixel. Se unir o próximo aos já computados não modificar a média mais de um certo valor, então ele é incluído na região. Se a média mudas mais que o fixado, ele será o início de uma nova região. Algumas implementações deixam o usuário escolher este valor. A implementação usada no Fiji deixa o usuário escolher um fator de complexidade, que é usado para calcular esta diferença.

Como o projeto é de código aberto, quem tiver curiosidade pode dar uma espiadinha nele neste link.

O exemplo

Primeiro precisamos que a nossa imagem seja de uma só banda. Podemos fazer isso apenas convertendo para 8 bits ou escolhendo a banda de maior contraste. Na minha experiencia a segunda opção sempre traz vantagens, mas vamos ver aqui…

Alternativas para conversão em tons de cinza: convertido para 8bits; banda R; banda G; banda B.

A imagem em que as folhas estão mais escuras e o fundo mais claro é a banda G (verde). É com essa que eu fico.

Agora o Crescimento de Regiões: mantenha apentas a imagem escolhida aberta, para evitar confusão. No menu Plugins –> Segmentation –> Statistical Region Merging. Aparecerá um diálogo que permite escolher o valor “Q” (é o valor de complexidade de que falei antes) e a optar por “Show averages” (mostrar médias) que influencia na maneira que você vai ver o resultado – eu prefiro deixar marcado.

Quanto ao valor de Q, o default é 25, e vou tentar primeiro com este. Ele gerou mais regiões do que eu gostaria, por isso vou tentar alguns mais baixos (mais tarde vamos comparar o resultado final). Minhas outras tentativas foram 15 e 5.

Imagem após crescimento de regiões: Q = 25; Q = 15; Q = 5.

Para o resultado final ainda precisamos de um último passo: o velho threshold:

Comparação dos resultados: mesma ordem da ilustração anterior.

Imagem segmentada diretamente por threshold.

Repare no canto superior esquerdo da primeira imagem: ainda temos um pouco de fundo. Há poucas deferenças entre a segunda (Q = 15) e a terceira (Q = 5), mas a última incluiu um pouco de fundo entre algumas folhas próximas. Mas a tentativa de segmentar diretamente por threshold não chegou nem perto da primeira…

Só para terminar com uma imagem bonita, vou usar o Image Calculator (Operação transparent-zero) entre a imagem segmentada e a original.

Só as folhas...

Créditos

Imagem de Marufish.

O algoritmo de crescimento de regiões implementado no Fiji está descrito em: R. Nock, F. Nielsen: Statistical Region Merging. IEEE Trans. Pattern Anal. Mach. Intell. 26(11): 1452-1458 (2004).

Para medir o crescimento das algas vou usar algumas ferramentas do ImageJ das quais ainda não falei aqui: Ferramentas de seleção manual e o ROI Manager; além das medições que já usei algumas vezes.

O problema

Placas com algas em crescimento. Imagens de Diego Sangiorgi.

Fiz uma montagem com as 5 imagens que recebi, com as placas em ordem. A primeira imagem tem menos algas e a última tem mais. Aos nossos olhos, a cor verde fica mais intensa conforme as imagens crescem. Por isso, seria de esperar que, medindo a intensidade do canal verde, teríamos uma boa relação com o crescimento das algas, certo?

ERRADO.

As próximas imagens são montagens feitas com os canais verdes e azuis, na mesma ordem das imagens originais. Não é possível ver diferença entre as imagens no canal verde, mas as do canal azul ficam mais escuras conforme as algas crescem. Isto acontece porque o que chamamos de verde tem bastante azul, quando representado no modelo de cor RGB.

Montagem do canal azul das algas.

Montagem com o canal verde das algas.

Preparação das imagens

Considerando que temos cinco imagens (e no experimento real poderiam ser mais), a melhor maneira de começar é abrindo todas elas e criando uma stack. Abra-as na ordem certa, para que o ImageJ monte a stack na ordem também. Depois de abrir todas as imagens, vá em Image –> Stacks –> Images to stack.

Para separar os canais, use Image –> Color –> Split Channels. Isto vai criar trés stacks em tons de cinza, com o canal identificado na barra de título. Identifique o canal azul (blue) e descarte os outros dois.

Identificação das áreas de medição

Para indicar ao ImageJ qual a área faz parte da placa de petri em cada imagem, vamos usar o ROI Mananger e uma ferramenta de seleção elíptica.

1. Primeiro abra do ROI Manager (gerenciador de regiões de interesse). Fica em Analyse –> Tools –> ROI Manager. Uma janela vazia, com alguns botões à direita.

2. Agora clique em , depois use clique e arraste sobre a imagem para desenhar uma elipse. Não se preocupe em acertar da primeira vez, você pode ajustar depois.

3. Quando estiver contente com a sua seleção, Clique no botão Add, do ROI Manager. Sua seleção (um grupo de números) vai aparecer na janela.

4. Repita a seleção para todas as imagens da sua Stack.

Quanto terminar, terá a janela do ROI Manager populada com suas amostras, ou regiões de interesse.

Medição

Antes de medir, precisamos informar ao programa quais medidas vamos usar. Precisamos apenas da intensidade do tom de cinza dos pixels. Abra o diálogo das medidas em Analyse –> Set Measurements… e selecione a opção Mean Gray Value (média dos valores de cinza).

Agora sim, medir: Clique no botão Measure do ROI Manager.

Resultados

Se tudo seu certo, o último passo deve ter aberto uma janela de resultados com esta:

O campo Mean traz a média de tons de cinza do canal azul de cada imagem. Ele decresce (fica mais escuro) enquanto as algas crescem, e sua cor vai ficando mais intensa.

A relação exata entre a diminuição da intensidade do azul só pode ser obtida por pesquisa, talvez relacionando o peso seco das algas à média da intensidade. Mas isso é a parte dos biólogos, que dominam a área de aplicação do método.

Créditos e Agradecimentos

As imagens e o assunto deste tutorial foram cedidos pelo estudante de biologia Diego Sangiorgi. Muito obrigada!